br />   起初大蛇丸还是在木叶的授权下，用志愿者的身体进行柱间细胞移植的试验，但由于结果全部失败，造成了大量牺牲，三代火影下令废止了这项研究。不过大蛇丸和团藏并没有死心，他们四处收集试验材料，不惜绑架婴儿，最终还是一无所获，当大蛇丸已经放弃，准备开始新的研究时，最后一个实验体竟然成功了，不过团藏没有告诉大蛇丸，而是私藏这个小孩，正是后来的木遁忍者大和。

  之后，大蛇丸的研究有了两项新的进展，一项是咒印，一项是秽土转生之术。咒印是大蛇丸从重吾身上发现的，通过移植咒印的力量，可以让人的肉体活性化，发挥出巨大的力量，并提高再生能力，这虽然不能让生命永恒，却可以让它不那么脆弱。但咒印移植的成功率很低，尤其是天之咒印，只有他在木叶时的徒弟红豆，以及佐助两人移植成功。而秽土转生是他偷学的禁术，在木叶封存的禁术馆里，大蛇丸发现了一屋子令他痴迷的禁术，包括威力强大的八岐之术，以及能让死者复生的秽土转生。大蛇丸欣喜若狂的同时，也不禁感叹：“想要学会所有的忍术，必须投入漫长的时间，但肉体的寿命实在太短暂了，死了的话便会失去一切。”于是，在学习秽土转生的同时，大蛇丸加快了对永生的探索。

  论是秽土转生还是其他试验，都需要大量素材，虽然有团藏的暗中支持，但在村里的下忍、中忍甚至上忍都接连失踪时，大蛇丸偷学禁术、进行人体实验的事实终于败露，三代火影亲自带队，突袭了大蛇丸的实验室。看到自己的徒弟犯下大罪，三代不忍心出手，放走了他，大蛇丸仓惶逃离木叶，开始了叛忍生涯。

  可能对于大蛇丸这种科学狂人来说，离开村子，不受约束，于人于己都更好，只是一个人的力量还不足够，他需要帮手，于是，大蛇丸找到了一名重要的部下，正是药师兜。

  其实早在忍界大战期间，大蛇丸就见过兜，那时他已是木叶的三忍，兜还是孤儿院的一名孤儿，大蛇丸称赞了他的医疗忍术，并认为他能成为优秀的忍者，但兜只想为孤儿院出力，只想报答收养他的院长。可是后来在团藏的安排下，兜被迫加入了根组织，并长期潜伏在各国进行间谍活动。多年后，由于兜知道了太多情报，团藏设计灭口，结果兜误杀了当年的孤儿院长，这就是另一个故事了。

  当大蛇丸找到兜的时候，他正处在崩溃中，大蛇丸与团藏关系密切，自然知道内情，于是把团藏对兜的欺骗全部告诉了他，兜顿时觉得这个世界上已无自己的立足之地。这时大蛇丸对他说：“我比任何人都重视你的才能，“我们一起创造一个与‘根’截然不同，能够找到自我的组织，一个不属于任何国家的音忍村。从现在起，你我二人脱离了木叶，我就是你的上司、兄弟和父亲。”这一番话让兜死心塌地，而大蛇丸也确实没有辜负他，对他视如己出，给予了最大的信任。